@phdthesis{Kunze,
  type      = {Bachelor Thesis},
  author    = {Dennis Kunze},
  title     = {Produktion von rekombinanten Proteinen zur Verwendung in Reagenzien f{\"u}r die in-vitro Diagnostik},
  url       = {https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bsz:mit1-opus4-62503},
  abstract  = {Hefen sind widerstandsf{\"a}hig, haben eine vergleichsweise hohe Reproduktionsrate und bieten eine Vielzahl posttranslationaler Modifikationen und Sekretionswege. Aus diesem Grund wurde die Hefe P. pastoris als Expressionswirt ausgesucht, um das Enzym Cholesterinesterase rekombinant herzustellen. Daf{\"u}r soll ein Klon mit hoher Enzymausbeute erzeugt werden. Zus{\"a}tzlich musste das optimale Kultivierungsmedium gefunden, die Langzeitstabilit{\"a}t ermittelt und gleichzeitig die Funktionalit{\"a}t in einem Reagenz nachgewiesen werden, in dem es sp{\"a}ter als eine Komponente eingesetzt werden soll. Es wurden die drei St{\"a}mme von P. pastoris X33, SMD1168H und KM71H eingesetzt, um jeweils die Plasmide pGAPZαA-COE1 und pGAPZαA-COE1-6H mithilfe der Elektroporation in die St{\"a}mme zu transformieren. In der Zelle wird das Plasmid durch homologe Rekombination in das Hefegenom integriert. Zum Linearisieren der Plasmid-DNA wurden die Restriktionsenzyme AvrII und BspHI eingesetzt. Daraus ergab sich die Kombination aus Stamm, Restrkitionsenzym und Konstrukt, welche den Klon mit der h{\"o}chsten Ausbeute erzeugt. So wurde der Klon E1 mit einer Enzymaktivit{\"a}t von 8,2 U/mL erzeugt, indem das Konstrukt pGAPZαA-COE1-6H mit dem Restriktionsenzym AvrII in den Stamm KM71H transformiert wurde. Die Enzymaktivit{\"a}t wurde mit einer Methode ermittelt, die auf der Reaktion des Enzyms mit p-Nitrophenoloctanoaten basiert. Im weiteren Verlauf wurde das Kultivierungsmedium f{\"u}r den Klon optimiert. Von den drei eingesetzten Medien SYN6, FM22 und YNB stellte sich SYN6 als das Medium mit der h{\"o}chsten Ausbeute heraus. Eine weiterf{\"u}hrende Variierung der CaCl-Konzentration im Kultivierungsmedium ergab eine optimale Konzentration von 1\%, bei gleichzeitiger Erh{\"o}hung der Langzeitstabilit{\"a}t. Zus{\"a}tzliche Versuche zur Erh{\"o}hung der Langzeitstabilit{\"a}t mit Zus{\"a}tzen wie RSA, Glycerin oder EDTA ergaben, dass die Langzeitstabilit{\"a}t am besten ohne jegliche Zus{\"a}tze garantiert werden kann. Weiterf{\"u}hrend muss {\"u}ber ein Scale-up Prozess nachgedacht werden und parallel dazu ein downstream-Prozess entwickelt werden, um die steigende Menge an Kultur{\"u}berstand verarbeiten zu k{\"o}nnen.},
  language  = {de}
}