@mastersthesis{Krauß2023,
  type      = {Bachelor Thesis},
  author    = {Krauß, Ludwig},
  title     = {Entwicklung eines Modellsystems zur diagnostischen Evaluierung von D-stereospezifischen Hydrolasen und -varianten},
  institution = {Angewandte Computer- und Bio­wissen­schaften},
  pages     = {82},
  year      = {2023},
  abstract  = {Im Rahmen der Arbeit sollte ein Modell zur Evaluierung des diagnostischen Einsatzes von D-stereospezifischen Hydrolasen- und varianten generiert werden. Als Modell diente artifizielles Parvulin 10 mit einer substituierten D-Aminos{\"a}uren. Dadurch musste eine halbysnthetische Synthese mit Fragmenten erfolgen. Das N-terminale Fragment (1-67), auch Thioester genannt, wurde aus E. coli an einer fusionierten Intein-Chitinbindedom{\"a}ne exprimiert. Mithilfe einer Kombination aus Affinit{\"a}tschromatographie und ver{\"a}ndertem Proteinspleißens konnte das Fragment an einer Chitins{\"a}ule zu einem Thioester umgebaut werden. Die erfolgreiche Expression und der Umbau mittels Proteinspleißens konnten dabei per SDS-Page erfolgreich nachgewiesen werden. In den C¬-terminalen Fragmenten (68-92), auch Peptide (Pf, Py, Pv) genannt, wurde jeweils eine L-Aminos{\"a}ure per SPPS in eine D-Aminos{\"a}ure substituiert. Diese Substitution ist f{\"u}r die Validierung der DHys erforderlich. Die Rohprodukte der SPPS konnten erfolgreich mittels pr{\"a}parativer HPLC gereinigt werden. Der Nachweis erfolgte mittels UPLC-MS. Durch eine anschließende initiale Hydrolysestudie der Peptide wurde die generelle Substratzug{\"a}nglichkeit f{\"u}r die DHys belegt. Die Auswertung erfolgte per UPLC-MS. Nachfolgend wurden beide Substrate mittels nat{\"u}rlich chemischer Ligation verkn{\"u}pft um Parvulin-Derivate zu erhalten. Die {\"U}berpr{\"u}fung erfolgte per SDS-Pages. Die Hydrolyse des Thioesters begrenzte die Ausbeute sehr stark. Die h{\"o}chste Ausbeute zeigten Ans{\"a}tze mit Peptid-Thioester-Verh{\"a}ltnis von 1:3, Thiophenol und der Zugabe von DMSO als L{\"o}sungsmittel. Es wurde kein quantitativer Umsatz erreicht. Deshalb war eine Reinigung des Ansatzes n{\"o}tig. Diese erfolgte Aufgrund verschiedener physikalisch-chemischen Eigenschaften der Reaktanten, Molekulargewichten, polarer Wechselwirkungen und Hydrophobizit{\"a}ten. Die Auswertung der Reinigungen erfolgte per SDS-Pages. Trennungen nach Hydrophobizit{\"a}t erwies sich am erfolgreichsten. Von dem gereinigten Parvulin-Derivat wurde die Aktivit{\"a}t mittels etabliertem Assay {\"u}berpr{\"u}ft. Es konnte die Generierung von aktivem artifiziellen Parvulin best{\"a}tigt werden. Das Modellprotein konnte erfolgreich dargestellt werden und steht f{\"u}r eine weiterf{\"u}hrende Untersuchung zur Validierung mit D-stereospezifischen Hydrolasen zur Verf{\"u}gung.},
  subject      = {Biochemie},
  language  = {de}
}