OPUS


Produktion von rekombinanten Proteinen zur Verwendung in Reagenzien für die in-vitro Diagnostik

  • Hefen sind widerstandsfähig, haben eine vergleichsweise hohe Reproduktionsrate und bieten eine Vielzahl posttranslationaler Modifikationen und Sekretionswege. Aus diesem Grund wurde die Hefe P. pastoris als Expressionswirt ausgesucht, um das Enzym Cholesterinesterase rekombinant herzustellen. Dafür soll ein Klon mit hoher Enzymausbeute erzeugt werden. Zusätzlich musste das optimale Kultivierungsmedium gefunden, die Langzeitstabilität ermittelt und gleichzeitig die Funktionalität in einem Reagenz nachgewiesen werden, in dem es später als eine Komponente eingesetzt werden soll. Es wurden die drei Stämme von P. pastoris X33, SMD1168H und KM71H eingesetzt, um jeweils die Plasmide pGAPZαA-COE1 und pGAPZαA-COE1-6H mithilfe der Elektroporation in die Stämme zu transformieren. In der Zelle wird das Plasmid durch homologe Rekombination in das Hefegenom integriert. Zum Linearisieren der Plasmid-DNA wurden die Restriktionsenzyme AvrII und BspHI eingesetzt. Daraus ergab sich die Kombination aus Stamm, Restrkitionsenzym und Konstrukt, welche den Klon mit der höchsten Ausbeute erzeugt. So wurde der Klon E1 mit einer Enzymaktivität von 8,2 U/mL erzeugt, indem das Konstrukt pGAPZαA-COE1-6H mit dem Restriktionsenzym AvrII in den Stamm KM71H transformiert wurde. Die Enzymaktivität wurde mit einer Methode ermittelt, die auf der Reaktion des Enzyms mit p-Nitrophenoloctanoaten basiert. Im weiteren Verlauf wurde das Kultivierungsmedium für den Klon optimiert. Von den drei eingesetzten Medien SYN6, FM22 und YNB stellte sich SYN6 als das Medium mit der höchsten Ausbeute heraus. Eine weiterführende Variierung der CaCl-Konzentration im Kultivierungsmedium ergab eine optimale Konzentration von 1%, bei gleichzeitiger Erhöhung der Langzeitstabilität. Zusätzliche Versuche zur Erhöhung der Langzeitstabilität mit Zusätzen wie RSA, Glycerin oder EDTA ergaben, dass die Langzeitstabilität am besten ohne jegliche Zusätze garantiert werden kann. Weiterführend muss über ein Scale-up Prozess nachgedacht werden und parallel dazu ein downstream-Prozess entwickelt werden, um die steigende Menge an Kulturüberstand verarbeiten zu können.

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Metadaten
Author:Dennis Kunze
URN:urn:nbn:de:bsz:mit1-opus4-62503
Document Type:Bachelor Thesis
Language:German
Year of Completion:2015
Granting Institution:Hochschule Mittweida
Release Date:2016/03/09
GND Keyword:Sterolesterase , Rekombinantes Protein , Pichia pastoris , Gentechnologie
Institutes:Angewandte Computer‐ und Bio­wissen­schaften
Dewey Decimal Classification:572 Biochemie
Access Rights:Frei zugänglich
Licence (German):License LogoEs gilt das UrhG