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Entwicklung eines Modellsystems zur diagnostischen Evaluierung von D-stereospezifischen Hydrolasen und -varianten

  • Im Rahmen der Arbeit sollte ein Modell zur Evaluierung des diagnostischen Einsatzes von D-stereospezifischen Hydrolasen- und varianten generiert werden. Als Modell diente artifizielles Parvulin 10 mit einer substituierten D-Aminosäuren. Dadurch musste eine halbysnthetische Synthese mit Fragmenten erfolgen. Das N-terminale Fragment (1-67), auch Thioester genannt, wurde aus E. coli an einer fusionierten Intein-Chitinbindedomäne exprimiert. Mithilfe einer Kombination aus Affinitätschromatographie und verändertem Proteinspleißens konnte das Fragment an einer Chitinsäule zu einem Thioester umgebaut werden. Die erfolgreiche Expression und der Umbau mittels Proteinspleißens konnten dabei per SDS-Page erfolgreich nachgewiesen werden. In den C¬-terminalen Fragmenten (68-92), auch Peptide (Pf, Py, Pv) genannt, wurde jeweils eine L-Aminosäure per SPPS in eine D-Aminosäure substituiert. Diese Substitution ist für die Validierung der DHys erforderlich. Die Rohprodukte der SPPS konnten erfolgreich mittels präparativer HPLC gereinigt werden. Der Nachweis erfolgte mittels UPLC-MS. Durch eine anschließende initiale Hydrolysestudie der Peptide wurde die generelle Substratzugänglichkeit für die DHys belegt. Die Auswertung erfolgte per UPLC-MS. Nachfolgend wurden beide Substrate mittels natürlich chemischer Ligation verknüpft um Parvulin-Derivate zu erhalten. Die Überprüfung erfolgte per SDS-Pages. Die Hydrolyse des Thioesters begrenzte die Ausbeute sehr stark. Die höchste Ausbeute zeigten Ansätze mit Peptid-Thioester-Verhältnis von 1:3, Thiophenol und der Zugabe von DMSO als Lösungsmittel. Es wurde kein quantitativer Umsatz erreicht. Deshalb war eine Reinigung des Ansatzes nötig. Diese erfolgte Aufgrund verschiedener physikalisch-chemischen Eigenschaften der Reaktanten, Molekulargewichten, polarer Wechselwirkungen und Hydrophobizitäten. Die Auswertung der Reinigungen erfolgte per SDS-Pages. Trennungen nach Hydrophobizität erwies sich am erfolgreichsten. Von dem gereinigten Parvulin-Derivat wurde die Aktivität mittels etabliertem Assay überprüft. Es konnte die Generierung von aktivem artifiziellen Parvulin bestätigt werden. Das Modellprotein konnte erfolgreich dargestellt werden und steht für eine weiterführende Untersuchung zur Validierung mit D-stereospezifischen Hydrolasen zur Verfügung.

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Metadaten
Author:Ludwig Krauß
Advisor:Röbbe Wünschiers, Frank Bordusa
Document Type:Bachelor Thesis
Language:German
Year of Completion:2023
Granting Institution:Hochschule Mittweida
Release Date:2023/06/30
GND Keyword:Biochemie
Page Number:82
Institutes:Angewandte Computer‐ und Bio­wissen­schaften
DDC classes:572 Biochemie
Open Access:Frei zugänglich
Licence (German):License LogoUrheberrechtlich geschützt