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Entwicklung einer Methode für die Basenmodifikation in Cereibacter sphaeroides mit Cas9

Development of a method for base modification in Cereibacter sphaeroides with Cas9

  • Die Arbeit beschäftigt sich mit dem Bakterium Cereibacter sphaeroides, seiner Fähigkeit zur Wasserstoffproduktion im Rahmen der Stickstofffixierung sowie den Möglichkeiten der genetischen Modifikation des Bakteriums. Ziel der Arbeit ist die Entwicklung eines Baseneditors, der mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems eine Zielregion modifizieren kann. Zur Erzeugung eines solchen Baseneditors wurde zunächst eine sgRNA synthetisiert und deren Funktion in einem in vitro Verdau mit Cas9 überprüft. Als Substrat wurden PCR-Produkte einer Region des rpoN-Gens verwendet. Dieses kodiert für den Transkriptionsfaktor σ54, welcher bei der Expression des Nitrogenasesystems eine Rolle spielt. Ein SNP auf diesem Gen steht im Verdacht mit der höheren Wasserstoffproduktion in Gegenwart von verfügbarem Stickstoff eines Substammes von C. sphaeroides zu stehen. Es zeigte sich, dass die sgRNA für die angestrebte Target-Region (rpoN-Gen) genutzt werden kann. Nach Etablierung des Cas9-Verdaus sollte ein Baseneditor mittels in vitro Proteinsynthese hergestellt und anschließend für eine Baseneditierung eingesetzt werden. Die Synthese des Baseneditors konnte bisher noch nicht erfolgreich abgeschlossen werden. Ein weiteres Teilprojekt befasste sich mit der Identifizierung von Kontaminationen in einigen Dauerkulturen von C. sphaeroides. Hierzu wurde ein 16s-Metabarcoding mittels Nanoporensequenzierung durchgeführt. Es wurde jedoch fast ausschließlich C. sphaeroides in der Sequenzierung nachgewiesen. Zukünftig sollen noch Optimierungen hinsichtlich der Synthese des Baseneditors vorgenommen werden. Anschließend soll der Baseneditor zur in vitro Basenmodifikation eingesetzt werden. Nach erfolgreicher in vitro Baseneditierung soll das System anschließend in ein in vivo System in C. sphaeroides implementiert werden. Langfristiges Ziel ist die Nutzung eines genetisch veränderten C. sphaeroides Stammes als Wasserstoffproduzent.

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Metadaten
Author:Anna Nauruschat
Advisor:Röbbe Wünschiers, Lisa Prudnikow
Document Type:Bachelor Thesis
Language:German
Year of Completion:2023
Granting Institution:Hochschule Mittweida
Release Date:2023/12/07
GND Keyword:Wasserstofferzeugung
Page Number:85
Institutes:Angewandte Computer‐ und Bio­wissen­schaften
DDC classes:665.81 Wasserstofferzeugung
Open Access:Frei zugänglich
Licence (German):License LogoUrheberrechtlich geschützt