572 Biochemie
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Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung der PCR-Chemie für Y-chromosomale SNP-Analysen, wobei eine vorangegangene Forschungsarbeit die Grundlage für den Optimierungsprozess bildet. Dabei soll auf die Verwendung eines kommerziellen Kits zur Durchführung der Amplifikation des genetischen Materials verzichtet werden. Die für die Analysen herangezogene DNA stammt aus historischem Knochenmaterial eines Gräberfeldes nahe Görzig. Abschließend sollen die untersuchten Proben hinsichtlich der detektierten Y-SNPs bewertet werden.
Die Arbeit dient als Grundlage für einen Aufbau von SPR-basierten DNA-Chips. Die Analyse der Immobilisierung und Hybridisierung erfolgte dabei in Echtzeit unter Nutzung der Spektroskopie der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR). Die SPR-Spektroskopie ermöglicht es, Änderungen des Brechungsindexes an der Metalloberfläche durch die Detektion einer Verschiebung des (Plasmonen-) Resonanzwinkels zu verfolgen. Diese Methode stellt eine markierungsfreie und sensitive Alternative zu Array-basierten Untersuchungen mit Fluoreszenzfarbstoffen, enzymatischen Reaktionen oder radioaktiven Markern dar. Als Metall wird häufig Gold eingesetzt, da es chemisch stabiler ist. Ziel soll es aber sein Silber als Grundlage zu verwenden, da mit dem Einsatz von Silber eine höhere Winkelauflösung erreicht werden kann und ein größeres Spektrum der Anregungswellenlänge für die SPR zugänglich ist. Um die Vorteile des Silbers nutzen zu können, ist es sinnvoll das Silber vor DNA Immobilisierung zu passivieren. Es wurden Glassubstrate nach mehreren Vorbehandlungsschritten mit Silber bedampft. Auf Basis dieser Substrate werden zwei verschiedene Strukturierungen untersucht. Im ersten Fall erfolgte eine Immobilisierung mit thiolmodifizierter DNA und anschließendem Blocken. Für die Immobilisierung dieser DNA wurden 2 Flächen auf dem Silbersubstrat genutzt, wobei eine Fläche die komplementäre DNA zur anderen Fläche gebunden hat. Auf beiden Flächen wurden die Immobilisierung, das Blocken und die anschließende Hybridisierung mit komplementärer DNA unter Nutzung von SPR-Spektroskopie durch Erhöhung des SPR-Signals beobachtet. Im zweiten Fall wurden einige Silbersubstrate mit 11-Mercapto-1-undecanol (MUD) passiviert. Durch eine Beschichtung mit (3-Bromopropyl)trichlorosilan war es möglich Phosphorothioat-DNA (PT-DNA) auf der Oberfläche zu immobilisieren. Es wurden verschiedene DNA-Konzentrationen komplementärer DNA von 0,25 μM, 0,5 μM und 1 μM für die Hybridisierung getestet. Dabei ergab sich, dass 0,25 μM keine signifikanten Signalerhöhungen bewirkten. Sowohl 0,5 μM als auch 1 μM komplementäre DNA brachten Signalerhöhungen. Auf dem passivierten Silber konnte im Vergleich zum unpassiviertem Silber eine deutlich geringere Signaldrift beobachtet werden. Der vorgenommene Schichtaufbau kann für DNA-Mikroarrays mit vielen Einzelnachweisen pro Flächeninhalt angewendet werden. Das passivierte Silber mit MUD und (3-Bromopropyl)trichlorosilan ist geeignet für Immobilisierung von PT-DNA und anschließende Hybridisierung mit komplementärer DNA.
Produktion von rekombinanten
Proteinen zur Verwendung in
Reagenzien für die in-vitro
Diagnostik
(2015)
Hefen sind widerstandsfähig, haben eine vergleichsweise hohe Reproduktionsrate und bieten eine Vielzahl posttranslationaler Modifikationen und Sekretionswege. Aus diesem Grund wurde die Hefe P. pastoris als Expressionswirt ausgesucht, um das Enzym Cholesterinesterase rekombinant herzustellen. Dafür soll ein Klon mit hoher Enzymausbeute erzeugt werden. Zusätzlich musste das optimale Kultivierungsmedium gefunden, die Langzeitstabilität ermittelt und gleichzeitig die Funktionalität in einem Reagenz nachgewiesen werden, in dem es später als eine Komponente eingesetzt werden soll. Es wurden die drei Stämme von P. pastoris X33, SMD1168H und KM71H eingesetzt, um jeweils die Plasmide pGAPZαA-COE1 und pGAPZαA-COE1-6H mithilfe der Elektroporation in die Stämme zu transformieren. In der Zelle wird das Plasmid durch homologe Rekombination in das Hefegenom integriert. Zum
Linearisieren der Plasmid-DNA wurden die Restriktionsenzyme AvrII und BspHI eingesetzt. Daraus ergab sich die Kombination aus Stamm, Restrkitionsenzym und Konstrukt, welche den Klon mit der höchsten Ausbeute erzeugt. So wurde der Klon E1 mit einer Enzymaktivität von 8,2 U/mL erzeugt, indem das Konstrukt pGAPZαA-COE1-6H mit dem Restriktionsenzym AvrII in den Stamm KM71H transformiert wurde. Die Enzymaktivität wurde mit einer Methode ermittelt, die auf der Reaktion des Enzyms mit p-Nitrophenoloctanoaten basiert. Im weiteren Verlauf wurde das Kultivierungsmedium für den Klon optimiert. Von den drei eingesetzten Medien SYN6, FM22 und YNB stellte sich SYN6 als das Medium mit der höchsten Ausbeute heraus.
Eine weiterführende Variierung der CaCl-Konzentration im Kultivierungsmedium ergab eine optimale Konzentration von 1%, bei gleichzeitiger Erhöhung der Langzeitstabilität.
Zusätzliche Versuche zur Erhöhung der Langzeitstabilität mit Zusätzen wie RSA, Glycerin oder EDTA ergaben, dass die Langzeitstabilität am besten ohne jegliche Zusätze garantiert werden kann. Weiterführend muss über ein Scale-up Prozess
nachgedacht werden und parallel dazu ein downstream-Prozess entwickelt werden, um die steigende Menge an Kulturüberstand verarbeiten zu können.