Vicia faba leaves and calli were transformed using CRISPR Cas RNP. Two kinds of CPP fused SpyCas9 were used with sgRNA7, sgRNA5 or sgRNA13 targeting PDS exon 1, PDS exon 2 or MgCh exon 3 respectively. RNP were applied using high pressure spraying, biolistic delivery, incubation in RNP solution and infiltration of leaf tissue. A PCR and restriction enzyme based approach was used for detection of mutation. Screening of 679 E. coli colonies containing the cloned fragments resulted in detection of 14 mutations. Most of the 14 mutations were deletions of sizes 150, 500 or 730 bp. 5 out of the 14 mutations were point mutations located two to three bp upstream of PAM.
Die Aminosäure Phenylalanin wird in vielen sekundären Stoffwechselwegen benötigt, so auch im Phenylpropanoid Stoffwechselweg. Feruloyl-CoA ist eines dieser Stoffe des Phenylpropanoid Stoffwechselwegs. Aus Feruloyl-CoA können unter anderem Cumarine und Suberin gebildet werden. Da beide Stoffe aus Feruloyl-CoA synthetisiert werden können wurden die Synthesewege dieser Stoffe auf Kompetitivität untersucht. Die Cumarinanalyse wurde an Nicotiana tabacum Zellkulturen und deren Medien mittels HPLC, Dünnschichtchromatographie und fotometrischen Messungen durchgeführt. Die Cumarine wurden über phenolische Extraktion aus den Zellen gewonnen, während die Cumarine aus den Medien durch Festphasenextraktion isoliert wurden. Suberin wurde an Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia und Arabidopsis thaliana Mutante Feruloyl-CoA 6’-hydroxylase, durch Anfärben des Suberins am Konfokalmikroskop untersucht. Arabidopsis thaliana und Nicotiana tabacum wurden auf eisenhaltigen und eisenmangel Medien kultiviert. Eine Erhöhte Bildung an Scopoletin und Scopolin konnte unter Eisenmangel nachgewiesen werden. Beide Organismen der Suberinanalyse wiesen eine unverändert starke Synthese auf, es wurden nur Änderungen im Suberinisierungsmuster beobachtet. Somit hat sich die Hypothese, dass es unter Eisenmangel zu einer geringeren Synthese von Suberin durch erhöhte Cumarinsynthese kommt, nicht bestätigt.