572.8 Molekularbiologie, Epigenetik
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Our current research aims to establish a complete ribonucleic acid (RNA) production line from plasmid design to purification of in vitro transcribed RNA and labeling of RNA. RNA is the central molecule within the central dogma of molecular biology and is involved in most essential processes within a cell[1]. In many cases, only compact three-dimensional structures of the respective RNA are able to fulfill their function. In this context, RNA tertiary contacts such as kissing loops and pseudoknots are essential to stabilize three-dimensional folding[2]. We will produce a tertiary contact consisting of a kissing loop and a GAAA tetraloop that occurs in eukaryotic ribosomal RNA[3,4]. The RNA sequence is integrated into a vector plasmid. Subsequently, the plasmid is amplified in E. coli. After following plasmid purification steps, the RNA sequence will be transcribed in vitro[5,6]. In order for the RNA be used for Förster resonance energy transfer (FRET) experiments at the single molecule level, fluorescent dyes must be coupled to the RNA molecule[7].
In dieser Arbeit wird der SAUZEROR-Algorithmus für Nukleotidstrukturen angepasst und auf seine Funktionalität und Performanz überprüft. DNA- und RNA-Strukturen sind in jeder lebenden Zelle vorhanden. Bei den RNA Strukturen haben die ncRNA eine immer größer werdende Bedeutung und die Funktion der ncRNA liegt in ihren geometrischen Aufbau. Der SAUZERORAlgorithmus erzeugt durch 3D-Koordinaten einer RNA-Struktur eine zER-Profil, welches eine 1D Repräsentation des Moleküles wiederspiegelt. Die zER-Profile können mit dynamsicher Programmierung aligniert werden und durch verschiede Scorings (zER-Score, NORM-Score, RMSD, GDT-TS oder TM-Score) bewertet werden. Für die Funktionalitätsprüfung wurden einzelene t-RNAs herangezogen und verglichen. Bei der Performanz ist der balance-x-FSCOR Benchmark benutzt wurden. Das Ergebnis war, dass der SAUZEROR-Algorithmus die wenigste Zeit benötigt und die zweitbeste Performanz abliefert.
Aufgrund einer immer älter werdenden Bevölkerung ist das Thema des gesunden
Alterns ein wichtiges Forschungsfeld. Dabei haben vor allem molekulare Prozesse eine bedeutende Rolle, weshalb auch die DNA ein bedeutendes Untersuchungsobjekt darstellt. Neben Mutationen auf Sequenzebene gibt es auch Veränderungen der DNA auf einer übergeordneten Ebene, welche die Sequenzabfolge selbst nicht verändern. Ein solcher Prozess ist die DNA-Methylierung, welche in allen höher entwickelten Eukaryonten von großer Bedeutung ist. Ein Modellorganismus, der in der Alternsforschung
immer mehr Beachtung fndet, ist der manuelle Fisch N. furzeri. Da zur
DNA-Methylierung im Organismus N. furzeri noch nichts bekannt ist, erfolgte im Rahmen dieser Masterarbeit eine Untersuchung der globalen DNA-Methylierung im Alterungsprozess des N. furzeri.
Krebs zählt zu den häufigsten Todesursachen. Die Suche nach neuen Wirkstoffen führt immer häufiger zu natürlichen Quellen. Das Heilkraut Artemisia annua L. bzw. dessen Sekundärmetabolit Artemisinin stellt einen Kandidaten zur Entwicklung neuer Krebsmedikament dar. Ursprünglich wurde Artemisinin in den 1970er Jahren als Mittel gegen Malaria entdeckt. Wie Studien beweisen konnten, weist die Verbindung auch eine selektive Wirkung gegen verschiedene Krebsarten auf. In dieser Arbeit wird Artemisinin bezüglich seiner Wirkung auf fünf humane Zelllinien (HeLa, 143B.TK-, HT-29, MCF-7, PC-3) untersucht, mit dem Ziel einen spezifischen Wirkort in den Mitochondrien zu identifizieren. Dafür werden die jeweiligen Krebszellen in Medium ohne Pyruvat und Uridin sowie in Medium mit beiden Zusätzen kultiviert. Nach einem Vorversuch wird der eigentliche Versuch mit der optimalen Artemisinin-Konzentration über sieben Tage durchgeführt. Die Ergebnisse umfassen mehrtägige mikroskopische Bildaufnahmereihen, Aufzeichnungen der Zellvitalität und der Gesamtlebendzellzahl sowie die relative Quantifizierung des mtDNA-Gehalts und des Expressionsniveaus respiratorischer Gene. Anhand dieser Untersuchungen kann davon ausgegangen werden, dass Artemisinin eine wachstumshemmende sowie zytotoxische Wirkung besitzt und in einigen der Zelllinien ebenso spezifisch in den Mitochondrien wirkt. Die Verbindung besitzt ein breites Wirkspektrum, was mit mehreren zellulären und molekularen Mechanismen assoziiert ist. Somit steht die Antikrebsaktivität von Artemisinin auch zusätzlich damit in Zusammenhang. Zudem besitzt Artemisinin eine unterschiedliche Wirksamkeit auf verschiedenen Arten von Tumorzellen.
Cell-free protein synthesis is gaining increasing importance in basic and applied research as a result of advances that have been made in the past years. This study successfully established a commercially available coupled in vitro transcription/translation system for DNA expression templates based on HeLa cell lysate and suitable detection methods. Possibilities to establish an inexpensive in-house CFPS system based on E. coli lysate were elucidated. Cell-free extract from E. coli strains HB101, JM109 and B (Luria) was generated using sonication and a streamlined procedure for the creation of a reaction mix for convenient and simple application in CFPS systems was established. Of the three strains tested using the in-house protocol, neither exhibited any CFPS activity.