572.8 Molekularbiologie, Epigenetik
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Our current research aims to establish a complete ribonucleic acid (RNA) production line from plasmid design to purification of in vitro transcribed RNA and labeling of RNA. RNA is the central molecule within the central dogma of molecular biology and is involved in most essential processes within a cell[1]. In many cases, only compact three-dimensional structures of the respective RNA are able to fulfill their function. In this context, RNA tertiary contacts such as kissing loops and pseudoknots are essential to stabilize three-dimensional folding[2]. We will produce a tertiary contact consisting of a kissing loop and a GAAA tetraloop that occurs in eukaryotic ribosomal RNA[3,4]. The RNA sequence is integrated into a vector plasmid. Subsequently, the plasmid is amplified in E. coli. After following plasmid purification steps, the RNA sequence will be transcribed in vitro[5,6]. In order for the RNA be used for Förster resonance energy transfer (FRET) experiments at the single molecule level, fluorescent dyes must be coupled to the RNA molecule[7].
Einfluss der Trauma-Zytokine TNFa, IL-6 und EPO auf das Transkriptom mesenchymaler Stammzellen
(2022)
Mit den Trauma-Zytokinen IL-6, TNFα & EPO wurde der Einfluss auf das Transkriptom mesenchymaler Hautstammzellen untersucht. Dabei wurde sich vor allem auf die Expression krebsassoziierte Gene konzentriert und untersucht, ob EPO möglichweise eine Verringerung der Expression solcher Gene hervorruft. Dazu hat man das Transkriptom von Zellen sequenziert, die unter Einfluss der Zytokinen in verschiedenen Zusammensetzung standen. Mithilfe einer differentiellen Expressionsanalyse (DE) konnte eine erhöhte Menge an RNA sowie erhöhte Expression von krebsassoziierten in den Zellen unter Einfluss der Zytokine festgestellt werden. Zellen, denen neben TNFα, IL-6 das Zytokin EPO hinzugegeben wurden, zeigten keine Verringerung krebsassoziierter Gene auf. Außerdem konnte eine Reaktion der Zellen auf eine durch TNFα und IL-6 simulierte Immunreaktion festgestellt werden. Auch Gene, die für Hautzellen eher untypisch sind, und somit noch einen unspezifischen Differenzierungsgrad der Stammzellen aufzeigen, konnten identifiziert werden.
In dieser Arbeit wird der SAUZEROR-Algorithmus für Nukleotidstrukturen angepasst und auf seine Funktionalität und Performanz überprüft. DNA- und RNA-Strukturen sind in jeder lebenden Zelle vorhanden. Bei den RNA Strukturen haben die ncRNA eine immer größer werdende Bedeutung und die Funktion der ncRNA liegt in ihren geometrischen Aufbau. Der SAUZERORAlgorithmus erzeugt durch 3D-Koordinaten einer RNA-Struktur eine zER-Profil, welches eine 1D Repräsentation des Moleküles wiederspiegelt. Die zER-Profile können mit dynamsicher Programmierung aligniert werden und durch verschiede Scorings (zER-Score, NORM-Score, RMSD, GDT-TS oder TM-Score) bewertet werden. Für die Funktionalitätsprüfung wurden einzelene t-RNAs herangezogen und verglichen. Bei der Performanz ist der balance-x-FSCOR Benchmark benutzt wurden. Das Ergebnis war, dass der SAUZEROR-Algorithmus die wenigste Zeit benötigt und die zweitbeste Performanz abliefert.
Aufgrund einer immer älter werdenden Bevölkerung ist das Thema des gesunden
Alterns ein wichtiges Forschungsfeld. Dabei haben vor allem molekulare Prozesse eine bedeutende Rolle, weshalb auch die DNA ein bedeutendes Untersuchungsobjekt darstellt. Neben Mutationen auf Sequenzebene gibt es auch Veränderungen der DNA auf einer übergeordneten Ebene, welche die Sequenzabfolge selbst nicht verändern. Ein solcher Prozess ist die DNA-Methylierung, welche in allen höher entwickelten Eukaryonten von großer Bedeutung ist. Ein Modellorganismus, der in der Alternsforschung
immer mehr Beachtung fndet, ist der manuelle Fisch N. furzeri. Da zur
DNA-Methylierung im Organismus N. furzeri noch nichts bekannt ist, erfolgte im Rahmen dieser Masterarbeit eine Untersuchung der globalen DNA-Methylierung im Alterungsprozess des N. furzeri.
Bioaerosole kommen ubiquitär in der Atmosphäre vor. Sie sind meist ungefährlich, aber sie können auch Bestandteile enthalten, welche eine gesundheitliche Gefahr für den Menschen darstellen. Um ihre Inhaltsstoffe zu ermitteln werden sie beprobt. Die biologische Untersuchung dieser Proben erfolgt über Kulturen und molekularbiologisch. In den Fokus der molekularbiologischen Auswertung rückt zurzeit das third generation sequencing via Nanopore. Ziel dieser Arbeit ist es zu prüfen, ob die durch den Coriolis μ generierten Luftproben zur molekularbiologischen Analyse mit Nanopore Sequenzierung nutzbar sind. Dazu werden kulturbasierte und molekularbiologische Untersuchungsmethoden angewendet und miteinander verglichen. Es wird gezeigt, dass die Proben für eine weitere Nutzung durch Nanopore Sequenzierung geeignet sind.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sind wichtige Proteinkomplexe für unzählige physiologische Funktionen und dienen als Startpunkt für moderne pharmazeutische Eingriffe. Trotz ihrer Fülle, bemerkenswerten Größe und Molekularstruktur, welche Zell- und Matrixkontakte in einer Vielzahl von Organsystemen ermöglicht, sind GPCR die am wenigsten verstandene Rezeptorklasse. Die Grundlagenforschung an der räumlichen GPCR-Struktur dient dem besseren Verständnis ihres strukturbasierten Wirkstoffdesigns, wodurch pharmazeutisch interessante Proteine mit Medikamenten spezifisch interagieren können. Dafür werden GPCR in „Human Embryonic Kidney“-Zellen (HEK293S-Zellen) exprimiert und anschließend mit der röntgenkristallografischen Analyse untersucht.
Krebs zählt zu den häufigsten Todesursachen. Die Suche nach neuen Wirkstoffen führt immer häufiger zu natürlichen Quellen. Das Heilkraut Artemisia annua L. bzw. dessen Sekundärmetabolit Artemisinin stellt einen Kandidaten zur Entwicklung neuer Krebsmedikament dar. Ursprünglich wurde Artemisinin in den 1970er Jahren als Mittel gegen Malaria entdeckt. Wie Studien beweisen konnten, weist die Verbindung auch eine selektive Wirkung gegen verschiedene Krebsarten auf. In dieser Arbeit wird Artemisinin bezüglich seiner Wirkung auf fünf humane Zelllinien (HeLa, 143B.TK-, HT-29, MCF-7, PC-3) untersucht, mit dem Ziel einen spezifischen Wirkort in den Mitochondrien zu identifizieren. Dafür werden die jeweiligen Krebszellen in Medium ohne Pyruvat und Uridin sowie in Medium mit beiden Zusätzen kultiviert. Nach einem Vorversuch wird der eigentliche Versuch mit der optimalen Artemisinin-Konzentration über sieben Tage durchgeführt. Die Ergebnisse umfassen mehrtägige mikroskopische Bildaufnahmereihen, Aufzeichnungen der Zellvitalität und der Gesamtlebendzellzahl sowie die relative Quantifizierung des mtDNA-Gehalts und des Expressionsniveaus respiratorischer Gene. Anhand dieser Untersuchungen kann davon ausgegangen werden, dass Artemisinin eine wachstumshemmende sowie zytotoxische Wirkung besitzt und in einigen der Zelllinien ebenso spezifisch in den Mitochondrien wirkt. Die Verbindung besitzt ein breites Wirkspektrum, was mit mehreren zellulären und molekularen Mechanismen assoziiert ist. Somit steht die Antikrebsaktivität von Artemisinin auch zusätzlich damit in Zusammenhang. Zudem besitzt Artemisinin eine unterschiedliche Wirksamkeit auf verschiedenen Arten von Tumorzellen.
Ziel der Bachelor Arbeit war die Untersuchung der Interaktion des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau an die Mikrotubuli mittels des Split-Luciferase-Assays. Dafür wurden die benötigten Expressionsplasmide hergestellt und die Interaktion im NanoBiT-Assay gemessen. Diese Messwerte wurden mithilfe des HiBiT-Assays normiert und mit dem Wst8-Assay sowie mit der Hoechst 33258 Färbung wurde die Zytotoxizität und die Zellzahl bestimmt.
Es konnten die Interaktionen zwischen β-Tubulin I/ III und Tau, α-Tubulin und Tau sowie α-Tubulin und β-Tubulin I/III gemessen werden. Das N-terminal fusionierte β-Tubulin I mit der kleinen Untereinheit und β-Tubulin III mit der großen Untereinheit konnten aufgrund fehlender Expressionsplasmide nicht in die Interaktionsanalyse mit einbezogen werden. Die optimale Konfiguration der Luciferase Untereinheiten sowie die bestmöglichsten Interaktionspartner, bei der die größte Interaktion von 0,2790 bzw. 0,3095 gemessen werden konnte war bei dem β-Tubulin I bzw. III mit dem Tau 36 TubbIII/ 34 2N4R bzw. 0N4R Tau. Hingegen entsprachen die optimale Konfiguration sowie die bestmöglichsten Interaktionspartner der Interaktion α-Tubulin mit Tau 33 TubaA/ 36 1N4R Tau sowie α-Tubulin mit β-Tubulin 33 TubaA/ 36 TubbI & TubbIII. Diese zeigten Interaktionsstärken von 0,1360; 0,1419 und 0,1668 im Vergleich zur PKA-Interaktion. Die Gegenüberstellung zu den Ergebnissen von Shin et al. zeigte eine übereinstimmende Konfiguration für die α-Tubulin/ Tau Interaktion, hingegen eine Differenz in der Konfiguration für die β-Tubulin/ Tau Interaktion. Die Ergebnisse des β-Tubulins mit den Tau Isoformen des Vektors pFC34 zeigten im T-Test eine signifikant größere Bindungsaffinität der Tau Isoformen mit 4 Mikrotubulibindungsregionen im Vergleich zu denen mit 3 Bindungsregionen.
Das folgende Werk behandelt die Vererbung epigenetischer Modulationen der menschlichen DNA und der daraus resultierenden Beeinflussung der Schuldfähigkeit und Verurteilungswürdigkeit eines erwachsenen Straftäters. Das Hauptaugenmerk soll dabei darauf liegen, herauszufinden, ob ein Mensch durch seine epigenetische Veranlagung dazu getrieben werden kann, eine Straftat zu begehen und inwiefern dies dessen Schuldfähigkeit und eine Verfolgung durch das deutsche Rechtssystem vermindert. Zusätzlich wird über den Aspekt der Willensfreiheit eines Menschen als Voraussetzung für dessen Schuldfähigkeit und für das Fortbestehen des deutschen Strafrechts diskutiert.