572.8028 CRISPR/Cas-Methode
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Aufbauend auf der CRISPR-FISH Methode, welche basierend auf dem CRISPRCas9-System die Detektion spezifischer DNA-Sequenzen mittels Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht, wird in dieser Arbeit versucht, eine weiterführende Methode zu entwickeln, um die Detektion spezifischer DNA-Sequenzen mithilfe eines Transmissionselektronenmikroskops und somit eine höhere Auflösung zu erreichen.
In this work, a transgenic zebrafish line that expresses the fluorophore dsRed under the endogenous zebrafish cochlin promotor is supposed to be established, using the CRISPR/Cas9 system. dsRed was cloned into a pBluescript vector, followed by the cloning of the cochlin locus into this vector. This bait construct was then supposed to be micro injected into wild type AB zebrafish embryos. The micro injection of Cas9 mRNA, single guide RNA and a bait construct was practiced with the tyrosinase gene, which was disrupted using CRISPR/Cas9.
Vicia faba leaves and calli were transformed using CRISPR Cas RNP. Two kinds of CPP fused SpyCas9 were used with sgRNA7, sgRNA5 or sgRNA13 targeting PDS exon 1, PDS exon 2 or MgCh exon 3 respectively. RNP were applied using high pressure spraying, biolistic delivery, incubation in RNP solution and infiltration of leaf tissue. A PCR and restriction enzyme based approach was used for detection of mutation. Screening of 679 E. coli colonies containing the cloned fragments resulted in detection of 14 mutations. Most of the 14 mutations were deletions of sizes 150, 500 or 730 bp. 5 out of the 14 mutations were point mutations located two to three bp upstream of PAM.
Die Arbeit befasst sich mit der Erstellung eines Tools zur Vorhersage von Transformationseffizienzen von CRISPR/Cas Systemen in Gerste (Hordeum vulgare L.). Es wurden 57 Zielsequenzen hinsichtlich ihrer Sequenzeigenschaften, wie GC Gehalt oder Entropie untersucht und Modelle für die Vorhersage von Effizienzen, für neue Sequenzen abgeleitet. Dabei konnten gute Vorhersagegenauigkeiten, erzielt werden. Außerdem wurden
mit Hilfe von k-mer Analysen Off-Target Effekte abgeschätzt, wobei hier der Vorteil gegenüber vergleichbaren Tools in der Verwendung von Sequenzrohdaten liegt. Somit kann das Tool auch für unassemblierte Genome genutzt werden.
