571.6 Cytologie
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Die vorliegende Bachelorarbeit befasst sich mit der Entwicklung eines 3D-Sehnen-Gewebemodells aus einer Triplettkultur. Dafür wurden Triplettkulturen aus Synovial-zellen, skelettalen Muskelzellen und mesenchymalen Stammzellen bzw. Tenozyten in 2D etabliert, wobei die Stammzellen tenogen differenziert werden sollten. Mithilfe der qPCR wurde die Expression von Markergenen eines jeden Zelltyps untersucht, um den Differenzierungserfolg, sowie den Einfluss der Triplettkultur zu charakterisieren. Zum Schluss erfolgte die Übertragung in eine 3D Umgebung.
Die PCR-basierte Ig/TCR-Klonalitätsanalyse bei Lymphomen wurde vom EuroClonality/BIOMED-2 Netzwerk standardisiert und erlangte den Weltstandard in der Routine Diagnostik. In dieser Arbeit wird ein PCR-basiertes Ig/TCR-Klonalitätsassay, basierend auf den Standard PCR-Protokollen, Primer-Sets und Richtlinien des Netzwerks entwickelt. Die PCR-Produktanalyse wird mithilfe des
Agilent 2100 Bioanalyzers (Mikrokapillar Elektrophorese) durchgeführt. Ziel ist es die hier entwickelte Methode in der Zentrum für Diagnostik GmbH am Klinikum Chemnitz für die Diagnose maligner B- und T-Lymphome an menschlichen FFPE-Gewebeproben zu etablieren. Dazu wird zunächst eine Optimierung der Probenvorbereitung, DNA-Aufreinigung und Multiplex PCR vorgenommen, um zuverlässige Ergebnisse sicherzustellen. Anschließend werden insgesamt 20 FFPE-Gewebeproben (13 B-Zell-Proben und 7 T-Zell-Proben) bezüglich ihrer Klonalität (monoklonal oder polyklonal) untersucht, da so die Differenzierung zwischen benignen (polyklonalen) und malignen (monoklonalen) Zellpopulationen möglich ist. Die erhaltenen Ergebnisse werden mit denen der Fremdbefunde abgeglichen, um die Genauigkeit beurteilen zu können. Zuletzt wird die Ig/TCR-Klonalitätsanalyse nach Standards wie Richtigkeit, Präzision und Sensitivität validiert.
Die vorliegende Bachelorarbeit befasst sich mit der Expression sowie der Analyse der Expressionseffizienz und Aufreinigung klonierter chimärer rekombinanter Antikörper mit dem Ziel der Entwicklung eines Vektorbaukastensystems zur Produktion von Antikörpern unterschiedlicher Spezies. Zu diesem Zweck wurde die Zelllinie MEXi-293E mit verschiedenen Expressionsplasmiden transfiziert und nachfolgend wurden Einzelklone isoliert. Die Überstände der Einzelklone wurden mit verschiedenen Methoden auf die Funktionalität und Menge der in ihnen befindlichen Antikörper hin analysiert. Weiterhin wurden die im Überstand befindlichen Antikörper affinitätschromatographisch aufgereinigt.
Erzeugung eines 3D-Lungengewebemodells mithilfe einer Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen-Zellkultur
(2023)
Die vorliegende Bachelorarbeit befasst sich mit der Etablierung und Entwicklung eines dreidimensionalen Lungengewebemodells auf Grundlage einer Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen- Zellkultur. Das In-vitro-Modell sollte die Grenzfläche zwischen dem luftgefüllten Raum der Lungenbläschen und dem Blut innerhalb der Kapillaren rekonstruieren. Für die Nachbildung des Lungenepithels kamen die Lungenkarzinomzelllinie A549 und die humanen primären Bronchialepithelzellen HBEpC zum Einsatz. Das Endothelgewebe wurde mit der somatischen Hybridzelllinie EA.hy926 und den Primärzellen HUVEC rekonstruiert. Die Eignung des entwickelten Modells wurde anhand der Ausbildung einer epithelialen Barrierefunktion sowie der Reaktion auf die Zugabe des Transforming Growth Factors 1 (TGF-β1) bewertet. Während der Etablierung wurde der Einfluss der Kokultivierung auf die epitheliale Barriere untersucht. Des Weiteren wurden verschiedene, kommerziell verfügbare Medien für die Air-Liquid-Interface-Kultur (ALI-Kultur) getestet. Als Anhaftungssubstrat für die Zellen wurden verschiedene Präparationen des extrazellulären Matrix-Proteins Kollagen eingesetzt. Die Kultivierung von Zellen an der Luft-Flüssigkeitsgrenze führte zur Expression spezieller Markergene, die mithilfe von Immunfluoreszenz und einer quantitativen Real-Time PCR quantifiziert wurden. Die Atembewegung ist für die Differenzierung ebenfalls essentiell und somit wichtiger Bestandteil zukünftiger und aussagekräftiger Lungen-in-vitro-Modelle. Diese mechanische Stimulation konnte unter Zuhilfenahme des vom Fraunhofer Institutes (IWS) entwickelten MPSstimulus realisiert werden, sodass es möglich war erste Untersuchungen zur zyklischen, physiologischen und mechanischen Dehnung von Lungenzellen durchzuführen.
Liegt in menschlichen Zellen eine Mutation im Enzym Isocitrat-Dehydrogenase 1 (IDH1) vor, kommt es zur einer erhöhten Produktion des Metaboliten D-2-Hydroxyglutarat (D2HG), wodurch die Entstehung weiterer Mutationen begünstigt wird. Um das IDH1-Enzym zu inhibieren und damit die D2HG-Konzentration in den Zellen zu verringern, sollten die Wirkstoffe AGI-5198 und FMLW-12 getestet werden. Dabei wurde zum einen die Zelllinie HT1080 mit der IDH1-Mutation R132C und zum anderen die Referenzzelllinien HeLa und 143B, die den Wildtyp aufweisen, verwendet.
Bei der Kultivierung der Zelllinie HT1080 mit AGI-5198 konnte neben einer langsameren Proliferation der Zellen auch eine Verringerung der D2HG-Konzentration beobachtet werden, was zeigt, dass AGI-5198 das mutierte IDH1 inhibiert. Bei HeLa und 143B zeigte sich keine Veränderung der D2HG-Konzentration, allerdings wirkte AGI-5198 in höheren Konzentrationen toxisch auf 143B.
Auch der Wirkstoff FMLW-12 konnte die D2HG-Konzentration in der Zelllinie HT1080 senken, während HeLa und 143B nicht beeinflusst wurden. Jedoch musste das Detergens Digitonin zur Permeabilisierung der Zellmembran eingesetzt werden, da FMLW-12 diese ansonsten nicht passieren konnte.