572 Biochemie
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Nutzung von CYTOF zur Detektion von ILC-Subpopulationen in der Haut von Patienten mit Psoriasis
(2022)
Psoriasis ist eine durch exogene und endogene Stimuli auslösbare, T-Zellen vermittelte Autoimmunerkrankung, die gekennzeichnet ist durch Hyperproliferation und veränderten Differenzierung von Keratinozyten in der Epidermis. Bei den Betroffenen bilden sich auf der Haut scharf begrenzte, rote oder mit weißen Schuppen bedeckte Papeln oder Plaques.
Man fand in den letzten Jahren heraus, dass eine neu entdeckte Lymphozyten Population, die sogenannten angeborenen lymphatischen Zellen (innate lymphoid cells (ILC)), einen Einfluss auf die Pathogenese der Erkrankung haben.
ILCs lassen sich anhand ihrer Oberflächenmarker in drei Gruppen einteilen. Besonders die Gruppe 3 der ILCs (ILC3) wurde in der Haut von Psoriasis-Patienten angereichert gefunden. Zum jetzigen Zeitpunkt ist jedoch nicht vollständig geklärt wie die ILCs vom Blut in das Gewebe migrieren.
Um ein besseres Verständnis über das Migrationsverhalten von ILCs bei Psoriasis zu erlangen, ist das Ziel der Arbeit, neue Subpopulation von ILCs zu identifizieren, die sowohl im Blut als auch auf dem Hautgewebe zu finden sind. Für die Etablierung dieser Methode wurden zuerst die im Blut von Psoriasis-Patienten und gesunden Patienten befindlichen ILCs durch Durchflusszytometrie von anderen Immunzellen getrennt. Mittels t-SNE-Algorithmus wurde anschließend innerhalb der ILC-Population nach Subpopulationen gesucht. Anhand von Oberflächenmarkern und fünf Chemokinrezeptoren, die unter anderem an der Migration beteiligt sind, konnten verschiedene ILC-Subpopulation identifiziert werden.
Um zu überprüfen, ob diese ILC-Subpopulation vom Blut ins Gewebe migrieren, sollten die ILC-Subpopulationen vom Blut anhand des Antikörperpanels der Durchflusszytometrie mittels „Imaging Mass Cytometry“ (IMC) im Gewebe von Psoriasis-Patienten identifiziert und lokalisiert werden. Vorteil von IMC gegenüber herkömmlicher Immunhistologie, ist die Nutzung von bis zu 40 parallel nutzbaren Markern im Gewebe. Dies ermöglicht die Suche nach ILC-Subpopulation durch die gleichzeitige Identifizierung von ILCs anhand von Oberflächenmarkern, als auch ihrer Chemokinrezeptoren.
In dieser Arbeit, konnte ein Antikörperpanel mit 30 Markern auf einem Gewebeschnitt untersucht und mittels der Programmiersprache R eine Analyse erstellt werden, die es erlaubt ILCs auf dem untersuchten Gewebe sichtbar zu machen, sowie die ILCs hinsichtlich der Expression ihrer Chemokinrezeptoren zu untersuchen.
Im Rahmen der Arbeit sollte ein Modell zur Evaluierung des diagnostischen Einsatzes von D-stereospezifischen Hydrolasen- und varianten generiert werden. Als Modell diente artifizielles Parvulin 10 mit einer substituierten D-Aminosäuren. Dadurch musste eine halbysnthetische Synthese mit Fragmenten erfolgen. Das N-terminale Fragment (1-67), auch Thioester genannt, wurde aus E. coli an einer fusionierten Intein-Chitinbindedomäne exprimiert. Mithilfe einer Kombination aus Affinitätschromatographie und verändertem Proteinspleißens konnte das Fragment an einer Chitinsäule zu einem Thioester umgebaut werden. Die erfolgreiche Expression und der Umbau mittels Proteinspleißens konnten dabei per SDS-Page erfolgreich nachgewiesen werden. In den C¬-terminalen Fragmenten (68-92), auch Peptide (Pf, Py, Pv) genannt, wurde jeweils eine L-Aminosäure per SPPS in eine D-Aminosäure substituiert. Diese Substitution ist für die Validierung der DHys erforderlich. Die Rohprodukte der SPPS konnten erfolgreich mittels präparativer HPLC gereinigt werden. Der Nachweis erfolgte mittels UPLC-MS. Durch eine anschließende initiale Hydrolysestudie der Peptide wurde die generelle Substratzugänglichkeit für die DHys belegt. Die Auswertung erfolgte per UPLC-MS. Nachfolgend wurden beide Substrate mittels natürlich chemischer Ligation verknüpft um Parvulin-Derivate zu erhalten. Die Überprüfung erfolgte per SDS-Pages. Die Hydrolyse des Thioesters begrenzte die Ausbeute sehr stark. Die höchste Ausbeute zeigten Ansätze mit Peptid-Thioester-Verhältnis von 1:3, Thiophenol und der Zugabe von DMSO als Lösungsmittel. Es wurde kein quantitativer Umsatz erreicht. Deshalb war eine Reinigung des Ansatzes nötig. Diese erfolgte Aufgrund verschiedener physikalisch-chemischen Eigenschaften der Reaktanten, Molekulargewichten, polarer Wechselwirkungen und Hydrophobizitäten. Die Auswertung der Reinigungen erfolgte per SDS-Pages. Trennungen nach Hydrophobizität erwies sich am erfolgreichsten. Von dem gereinigten Parvulin-Derivat wurde die Aktivität mittels etabliertem Assay überprüft. Es konnte die Generierung von aktivem artifiziellen Parvulin bestätigt werden. Das Modellprotein konnte erfolgreich dargestellt werden und steht für eine weiterführende Untersuchung zur Validierung mit D-stereospezifischen Hydrolasen zur Verfügung.
Das Bundesamt für Umwelt definiert Endokrine Disruptoren als ,,Chemikalien oder Mischungen von Chemikalien, die die natürliche biochemische Wirkweise von Hormonen stören und dadurch schädliche Effekte (…) hervorrufen.‘‘ [Umweltbundesamt, 2020]. Zum Schutz von Mensch und Natur ist eine effektive Eliminierung von diesen Substanzen notwendig, was jedoch eine sensitive Detektion voraussetzt. Mit Hilfe von Reporter-Gen-Assays wie z.B. dem A-YES lassen sich estrogenwirksame Substanzen in Wasser nachweisen. Im Zuge der kontinuierlichen Optimierung der Hefezell-Assays der new_diagnostics GmbH sollte in dieser Arbeit durch Integration des alternativen Reporterenzyms Meerrettichperoxidase (HRP) in Hefebiosensoren die Möglichkeit geprüft werden, inwieweit eine Verbesserung der Testsensitivität und/oder die Vereinfachung von Verfahrensabläufen möglich ist. Nach Aufbau dafür notwendiger Hrp-Kassetten bzw. Plasmide konnte gezeigt werden, dass diese erfolgreich in den Hefesystemen d.h. in A. adeninivorans und in S. cerevisiae integriert werden konnten. Für die Bewertung der Funktionalität von hefeproduzierter HRP wurde im Vorfeld eine Analytik etabliert, die die Detektion funktionaler HRP bis zu einer Konzentration von ca. ≥ 0,2 Units/ml ermöglichte.
In dieser Arbeit wurden neuartige Proteasen aus psychrotoleranten Bakterienstämmen isoliert und auf ihre biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Des Weiteren konnten S8 Familie Proteasen Gene amplifiziert werden und Unterschiede in der Aminosäuresequenz konnten in Zusammenhang mit den biochemischen Eigenschaften der Proteasen in Verbindung gebracht werden.