579.256 RS-Virus
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Diese Arbeit beinhaltet die Durchführung unterschiedlicher SARS-CoV-2-Untersuchungen mit dem LC CFX96 der Firma BIO-RAD, mit deren Ergebnissen der Laboralltag und Routineablauf der SARS-CoV-2-PCR optimiert werden soll. Dabei soll das Hauptaugenmerk auf vier Schwerpunkte gelegt werden, zu denen die Wahl einer geeigneten Isolationsmethode, der Vergleich von Nasopharyngealabstrich und Rachen-Spülflüssigkeit, die Überprüfung der Haltbar- und Reproduzierbarkeit von isolierten Proben sowie das Bestimmen einer optimalen Lagermöglichkeit der Rachen-Nasenabstriche gehört.
In dieser Arbeit wurde das SARS-CoV-2 Nukleokapsid-Protein sowie dessen N- und C-terminale Domäne kloniert und die darauf folgende Expression in E.coli und die Aufreinigung optimiert. Anschließend wurden die Proteine als Antigene für indirekte ELISAs verwendet. Die IgG-Antwort aus Seren von COVID-19 Patienten wurde bestimmt, um die Sensitivität und Spezifität hinsichtlich der Detektionsfähigkeit gegenüber den Varianten des N-Proteins zu vergleichen. Weiterhin wurde das Verhalten dieser Immunantworten über einen Zeitraum der akuten Infektion bis frühen Konvaleszenz mit einem Zeitraum von bis zu 10 Monaten nach Symptombeginn bei verschiedenen klinischen Schweregraden untersucht.
Durch Eindringen in die Wirtszelle kann sich das SARS-CoV-2-Virus verbreiten. Das adaptive Immunsystem bildet verzögert die humorale Immunantwort durch hochspezifische Antikörper aus. Die Antikörper neutralisieren das SARS-CoV-2. Im Laufe der Immunabwehr steigen die Antikörpertiter der verschiedenen Antikörperklassen unterschiedlich an. Mittels Serumproben sollte herausgefunden werden, wie der IgG-Titer nach einem positiven PCR-Ergebnis von der Zeit abhängig verläuft und ob es Unterschiede zwischen verschiedenen Geschlechtern und Altersklassen gibt. Für die Ermittlung der IgG-Titer wurden einmal der ELISA mittels Generic Assays CoV-2 IgG und einmal der CLIA mittels LIAISON® SARS-CoV-2 TrimericS IgG angewandt. Zudem fand eine Vergleichsmessung der Tests statt.
Im Allgemeinen stieg der Titer innerhalb der ersten 50 Tage an, da sich in dieser Zeit die IgG-Antikörper ab Tag 14 bilden, und erreichte das Maximum im Bereich 40-50 Tage. Danach fiel der Titer leicht bis auf 60 -70 % des Maximums, da die Antikörper nach und nach absterben.
Die Vergleichsmessung ergab einen linearen Zusammenhang von 64 % zwischen Generic Assays und LIAISON®. Bezogen auf die qualitative Aussage der Tests gab es eine 96 % Übereinstimmung der Ergebnisse.
Es wird die Entwicklung eines Reversen Genetik Systems für das Respiratorische Synzytial Virus beschrieben. Die Ergebnisse für die Versuche zur Subklonierung von RSV-Antigenomfragmenten in Klonierungsvektoren, sowie der Ligation zweier RSV-Antigenomfragmente miteinander und anschließend in einem Expressionsvektor werden dargestellt und diskutiert. Die Methoden die zu diesen Ergebnissen führten werden aufgeführt, diskutiert und mit Literatur verglichen. Des Weiteren werden die Erfolge und Misserfolge zusammengefasst und in Form des Ausblickes dargestellt, welche weiteren Schritte zur Entwicklung eines Reversen Genetik Systems für das Respiratorische Synzytial Virus geplant sind.