572 Biochemie
Protein structures are essential elements in every biological system evolved on earth, where they function as stabilizing elements, signaltransducers or replication machin eries. They are consisting of linear-bonded amino acids, which determine the three-dimensional structure of the protein, whereas the structure in turn determines the function. The native and biological active structure ofa protein can be understood as the folding state of a polypeptide chain at the global minimum of free energy.
By means of protein energy profiling, which is an approach derived from statistical physics it is possible to assign a so called energy profile to a protein structure. Such an energy profile describes the local energetic interaction features of every amino acid within the structure and introduces an energetic point of view, instead of a structural or sequential onto proteins.
This work aims to give a perspective to the question of how we may gain pattern information out of energy profiles. The concrete subjects are energy-mapped Pfam family alignments and investigations on finding motifs or patterns indiscretizised energy profile segments.
Die Arbeit dient als Grundlage für einen Aufbau von SPR-basierten DNA-Chips. Die Analyse der Immobilisierung und Hybridisierung erfolgte dabei in Echtzeit unter Nutzung der Spektroskopie der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR). Die SPR-Spektroskopie ermöglicht es, Änderungen des Brechungsindexes an der Metalloberfläche durch die Detektion einer Verschiebung des (Plasmonen-) Resonanzwinkels zu verfolgen. Diese Methode stellt eine markierungsfreie und sensitive Alternative zu Array-basierten Untersuchungen mit Fluoreszenzfarbstoffen, enzymatischen Reaktionen oder radioaktiven Markern dar. Als Metall wird häufig Gold eingesetzt, da es chemisch stabiler ist. Ziel soll es aber sein Silber als Grundlage zu verwenden, da mit dem Einsatz von Silber eine höhere Winkelauflösung erreicht werden kann und ein größeres Spektrum der Anregungswellenlänge für die SPR zugänglich ist. Um die Vorteile des Silbers nutzen zu können, ist es sinnvoll das Silber vor DNA Immobilisierung zu passivieren. Es wurden Glassubstrate nach mehreren Vorbehandlungsschritten mit Silber bedampft. Auf Basis dieser Substrate werden zwei verschiedene Strukturierungen untersucht. Im ersten Fall erfolgte eine Immobilisierung mit thiolmodifizierter DNA und anschließendem Blocken. Für die Immobilisierung dieser DNA wurden 2 Flächen auf dem Silbersubstrat genutzt, wobei eine Fläche die komplementäre DNA zur anderen Fläche gebunden hat. Auf beiden Flächen wurden die Immobilisierung, das Blocken und die anschließende Hybridisierung mit komplementärer DNA unter Nutzung von SPR-Spektroskopie durch Erhöhung des SPR-Signals beobachtet. Im zweiten Fall wurden einige Silbersubstrate mit 11-Mercapto-1-undecanol (MUD) passiviert. Durch eine Beschichtung mit (3-Bromopropyl)trichlorosilan war es möglich Phosphorothioat-DNA (PT-DNA) auf der Oberfläche zu immobilisieren. Es wurden verschiedene DNA-Konzentrationen komplementärer DNA von 0,25 μM, 0,5 μM und 1 μM für die Hybridisierung getestet. Dabei ergab sich, dass 0,25 μM keine signifikanten Signalerhöhungen bewirkten. Sowohl 0,5 μM als auch 1 μM komplementäre DNA brachten Signalerhöhungen. Auf dem passivierten Silber konnte im Vergleich zum unpassiviertem Silber eine deutlich geringere Signaldrift beobachtet werden. Der vorgenommene Schichtaufbau kann für DNA-Mikroarrays mit vielen Einzelnachweisen pro Flächeninhalt angewendet werden. Das passivierte Silber mit MUD und (3-Bromopropyl)trichlorosilan ist geeignet für Immobilisierung von PT-DNA und anschließende Hybridisierung mit komplementärer DNA.
Die ubiquitäre, anthropogene Ausbreitung von pharmazeutischen Substanzen in der Umwelt, stellt ein weitreichendes Problem für alle Lebewesen dar. Hormone, die auf unterschiedlichsten Wegen in den aquatischen Lebensraumgelangen, sind unter anderem verantwortlich für das Fischsterben. Da sich die Anwesenheit dieser Stoffe allgemein und besonders bei Hormonen in der Umwelt nur auf geringe Konzentrationen begrenzt und sie dabei dennoch ein großes Risiko darstellen, sind geeignete Methoden zum Nachweis und zur Entfernung dieser Stoffe aus dem aquatischen System notwendig. Diezbezüglich sollen bereits etablierte biosensorische Detektionsmethoden unter Einsatz von Aptameren untersucht werden, um niedermolekulare Substanzen zu detektieren. Das Zielmolekül stellt dabei das Hormon 17ß-Estradiol, dass auf der Beobachtungsliste der EU Wasserrahmenrichtlinie steht und zu welchem bereits spezifische Aptamere veröffentlich sind, dar.