572 Biochemie
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- Bindestelle , Interleukin 8 , Chondroitinsulfate , Massenspektrometrie (1)
- Biosensor , Biomolekül , Ligand (1)
- Butanol <1-> , Stoffwechselweg , Arxula adeninivorans , Biotechnologie (1)
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- Sterolesterase , Rekombinantes Protein , Pichia pastoris , Gentechnologie (1)
- Y-Chromosom (1)
Ovarialkarzinome weisen häufig Mutationen innerhalb des Tumorsuppressorgens p53 auf, auf die das menschliche Immunsystem mit Autoantikörpern reagiert. Aber nicht alle Patienten bilden diese Autoantikörper. Warum das so ist, haben Forscher noch nicht herausgefunden. Diese Arbeit versucht eine Korrelation zwischen Immunzellpopulationen und Autoantikörper-Status zu finden.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung der PCR-Chemie für Y-chromosomale SNP-Analysen, wobei eine vorangegangene Forschungsarbeit die Grundlage für den Optimierungsprozess bildet. Dabei soll auf die Verwendung eines kommerziellen Kits zur Durchführung der Amplifikation des genetischen Materials verzichtet werden. Die für die Analysen herangezogene DNA stammt aus historischem Knochenmaterial eines Gräberfeldes nahe Görzig. Abschließend sollen die untersuchten Proben hinsichtlich der detektierten Y-SNPs bewertet werden.
In dieser Arbeit werden Interaktionen auf molekularer Ebene mittels eines Biosensors, einer Quarzkristallmikrowaage analysiert. Bei den experimentell genutzten Interaktionsmolekülen handelt es sich beim ersten Paar um Cyclophilin A und
Cyclosporin A und beim Zweiten um Anti-c-Myc und c-Myc. Die Sensoroberflächen können definiert modifiziert werden. Unter Verwendung des Biotin-Avidin-Systems werden Affinitäten in Echtzeit ermittelt und die Sensoren für weitere
Echtzeitmesszyklen regeneriert. Dieses Analyseverfahren soll im Vergleich zu einer vielzahl anderer Verfahren durch seine Zeit-, Kosten- und Materialersparnis beeindrucken und den Wunsch nach Weiterentwicklung vorantreiben.
Aufgrund der hohen Sensitivität und der schnellen Durchführbarkeit gewinnt die
Wasserstoff-/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie immer mehr an
Bedeutung. In dieser Arbeit liegt der Fokus auf der strukturellen Untersuchung von Protein-Zucker-Interaktionen am Beispiel von Interleukin-8 und Chondroitinsulfat, um mit Hilfe des Wasserstoff-/Deuterium-Austauschs die Interaktionsstellen zu identifizieren. In dieser Arbeit wurde mit zwei verschiedenen Herangehensweisen das Protein sowohl einzeln, als auch im Komplex mit einem Glykosaminoglykan hinsichtlich seines Austauschverhaltens untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es mittels H-/D-Austausch-Massenspektrometrie die Bindungsstelle von Interleukin-8 zu oligomeren Chondroitinsulfat-Molekülen zu bestimmen.
Produktion von rekombinanten
Proteinen zur Verwendung in
Reagenzien für die in-vitro
Diagnostik
(2015)
Hefen sind widerstandsfähig, haben eine vergleichsweise hohe Reproduktionsrate und bieten eine Vielzahl posttranslationaler Modifikationen und Sekretionswege. Aus diesem Grund wurde die Hefe P. pastoris als Expressionswirt ausgesucht, um das Enzym Cholesterinesterase rekombinant herzustellen. Dafür soll ein Klon mit hoher Enzymausbeute erzeugt werden. Zusätzlich musste das optimale Kultivierungsmedium gefunden, die Langzeitstabilität ermittelt und gleichzeitig die Funktionalität in einem Reagenz nachgewiesen werden, in dem es später als eine Komponente eingesetzt werden soll. Es wurden die drei Stämme von P. pastoris X33, SMD1168H und KM71H eingesetzt, um jeweils die Plasmide pGAPZαA-COE1 und pGAPZαA-COE1-6H mithilfe der Elektroporation in die Stämme zu transformieren. In der Zelle wird das Plasmid durch homologe Rekombination in das Hefegenom integriert. Zum
Linearisieren der Plasmid-DNA wurden die Restriktionsenzyme AvrII und BspHI eingesetzt. Daraus ergab sich die Kombination aus Stamm, Restrkitionsenzym und Konstrukt, welche den Klon mit der höchsten Ausbeute erzeugt. So wurde der Klon E1 mit einer Enzymaktivität von 8,2 U/mL erzeugt, indem das Konstrukt pGAPZαA-COE1-6H mit dem Restriktionsenzym AvrII in den Stamm KM71H transformiert wurde. Die Enzymaktivität wurde mit einer Methode ermittelt, die auf der Reaktion des Enzyms mit p-Nitrophenoloctanoaten basiert. Im weiteren Verlauf wurde das Kultivierungsmedium für den Klon optimiert. Von den drei eingesetzten Medien SYN6, FM22 und YNB stellte sich SYN6 als das Medium mit der höchsten Ausbeute heraus.
Eine weiterführende Variierung der CaCl-Konzentration im Kultivierungsmedium ergab eine optimale Konzentration von 1%, bei gleichzeitiger Erhöhung der Langzeitstabilität.
Zusätzliche Versuche zur Erhöhung der Langzeitstabilität mit Zusätzen wie RSA, Glycerin oder EDTA ergaben, dass die Langzeitstabilität am besten ohne jegliche Zusätze garantiert werden kann. Weiterführend muss über ein Scale-up Prozess
nachgedacht werden und parallel dazu ein downstream-Prozess entwickelt werden, um die steigende Menge an Kulturüberstand verarbeiten zu können.
Die zugrunde liegenden Arbeiten hatten die Steigerung der Synthesekapazitäten von n-Butanol in Arxula adeninivorans zum Ziel.
Da der Wirtsorganismus n-Butanol als exklusive Kohlenstoffquelle nutzen kann, sind Arbeiten zur Reduzierung des Butanolkatabolismus notwendig. Zu diesem Zweck wurde das Gen für eine der Aldehydehydrogenasen von A. adeninivorans ausgewählt, um diese durch homologe Rekombination zu deletieren. Zur Untersuchung des Transformationserfolges wurde eine Charakterisierung der Transformanden durchgeführt. Eine Validierung erfolgte durch Duplex-PCR und n-Butanolver-brauchsmessungen mittels GC/MS.