572 Biochemie
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Keywords
- Bindestelle , Interleukin 8 , Chondroitinsulfate , Massenspektrometrie (1)
- Biosensor , Biomolekül , Ligand (1)
- Biotechnologie , Pharmazeutische Technologie , Nutzwertanalyse (1)
- Butanol <1-> , Stoffwechselweg , Arxula adeninivorans , Biotechnologie (1)
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- Oberfläche (1)
Ziel dieser Diplomarbeit ist es zwei zur Auswahl stehende
Produktionstechnologien zur rekombinanten Blutgerinnungsfaktor VIII Herstellung
anhand fiktiver Investitionsprojekte sowohl monetärals auch nicht-monetär zu
bewerten und somit eine Entscheidungsgrundlage für zukünftige Investitionen zur
Verfügung zu stellen.
Die zugrunde liegenden Arbeiten hatten die Steigerung der Synthesekapazitäten von n-Butanol in Arxula adeninivorans zum Ziel.
Da der Wirtsorganismus n-Butanol als exklusive Kohlenstoffquelle nutzen kann, sind Arbeiten zur Reduzierung des Butanolkatabolismus notwendig. Zu diesem Zweck wurde das Gen für eine der Aldehydehydrogenasen von A. adeninivorans ausgewählt, um diese durch homologe Rekombination zu deletieren. Zur Untersuchung des Transformationserfolges wurde eine Charakterisierung der Transformanden durchgeführt. Eine Validierung erfolgte durch Duplex-PCR und n-Butanolver-brauchsmessungen mittels GC/MS.
Ovarialkarzinome weisen häufig Mutationen innerhalb des Tumorsuppressorgens p53 auf, auf die das menschliche Immunsystem mit Autoantikörpern reagiert. Aber nicht alle Patienten bilden diese Autoantikörper. Warum das so ist, haben Forscher noch nicht herausgefunden. Diese Arbeit versucht eine Korrelation zwischen Immunzellpopulationen und Autoantikörper-Status zu finden.
Protein structures are essential elements in every biological system evolved on earth, where they function as stabilizing elements, signaltransducers or replication machin eries. They are consisting of linear-bonded amino acids, which determine the three-dimensional structure of the protein, whereas the structure in turn determines the function. The native and biological active structure ofa protein can be understood as the folding state of a polypeptide chain at the global minimum of free energy.
By means of protein energy profiling, which is an approach derived from statistical physics it is possible to assign a so called energy profile to a protein structure. Such an energy profile describes the local energetic interaction features of every amino acid within the structure and introduces an energetic point of view, instead of a structural or sequential onto proteins.
This work aims to give a perspective to the question of how we may gain pattern information out of energy profiles. The concrete subjects are energy-mapped Pfam family alignments and investigations on finding motifs or patterns indiscretizised energy profile segments.
In dieser Arbeit werden Interaktionen auf molekularer Ebene mittels eines Biosensors, einer Quarzkristallmikrowaage analysiert. Bei den experimentell genutzten Interaktionsmolekülen handelt es sich beim ersten Paar um Cyclophilin A und
Cyclosporin A und beim Zweiten um Anti-c-Myc und c-Myc. Die Sensoroberflächen können definiert modifiziert werden. Unter Verwendung des Biotin-Avidin-Systems werden Affinitäten in Echtzeit ermittelt und die Sensoren für weitere
Echtzeitmesszyklen regeneriert. Dieses Analyseverfahren soll im Vergleich zu einer vielzahl anderer Verfahren durch seine Zeit-, Kosten- und Materialersparnis beeindrucken und den Wunsch nach Weiterentwicklung vorantreiben.
Aufgrund der hohen Sensitivität und der schnellen Durchführbarkeit gewinnt die
Wasserstoff-/Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie immer mehr an
Bedeutung. In dieser Arbeit liegt der Fokus auf der strukturellen Untersuchung von Protein-Zucker-Interaktionen am Beispiel von Interleukin-8 und Chondroitinsulfat, um mit Hilfe des Wasserstoff-/Deuterium-Austauschs die Interaktionsstellen zu identifizieren. In dieser Arbeit wurde mit zwei verschiedenen Herangehensweisen das Protein sowohl einzeln, als auch im Komplex mit einem Glykosaminoglykan hinsichtlich seines Austauschverhaltens untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es mittels H-/D-Austausch-Massenspektrometrie die Bindungsstelle von Interleukin-8 zu oligomeren Chondroitinsulfat-Molekülen zu bestimmen.
Die Arbeit dient als Grundlage für einen Aufbau von SPR-basierten DNA-Chips. Die Analyse der Immobilisierung und Hybridisierung erfolgte dabei in Echtzeit unter Nutzung der Spektroskopie der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR). Die SPR-Spektroskopie ermöglicht es, Änderungen des Brechungsindexes an der Metalloberfläche durch die Detektion einer Verschiebung des (Plasmonen-) Resonanzwinkels zu verfolgen. Diese Methode stellt eine markierungsfreie und sensitive Alternative zu Array-basierten Untersuchungen mit Fluoreszenzfarbstoffen, enzymatischen Reaktionen oder radioaktiven Markern dar. Als Metall wird häufig Gold eingesetzt, da es chemisch stabiler ist. Ziel soll es aber sein Silber als Grundlage zu verwenden, da mit dem Einsatz von Silber eine höhere Winkelauflösung erreicht werden kann und ein größeres Spektrum der Anregungswellenlänge für die SPR zugänglich ist. Um die Vorteile des Silbers nutzen zu können, ist es sinnvoll das Silber vor DNA Immobilisierung zu passivieren. Es wurden Glassubstrate nach mehreren Vorbehandlungsschritten mit Silber bedampft. Auf Basis dieser Substrate werden zwei verschiedene Strukturierungen untersucht. Im ersten Fall erfolgte eine Immobilisierung mit thiolmodifizierter DNA und anschließendem Blocken. Für die Immobilisierung dieser DNA wurden 2 Flächen auf dem Silbersubstrat genutzt, wobei eine Fläche die komplementäre DNA zur anderen Fläche gebunden hat. Auf beiden Flächen wurden die Immobilisierung, das Blocken und die anschließende Hybridisierung mit komplementärer DNA unter Nutzung von SPR-Spektroskopie durch Erhöhung des SPR-Signals beobachtet. Im zweiten Fall wurden einige Silbersubstrate mit 11-Mercapto-1-undecanol (MUD) passiviert. Durch eine Beschichtung mit (3-Bromopropyl)trichlorosilan war es möglich Phosphorothioat-DNA (PT-DNA) auf der Oberfläche zu immobilisieren. Es wurden verschiedene DNA-Konzentrationen komplementärer DNA von 0,25 μM, 0,5 μM und 1 μM für die Hybridisierung getestet. Dabei ergab sich, dass 0,25 μM keine signifikanten Signalerhöhungen bewirkten. Sowohl 0,5 μM als auch 1 μM komplementäre DNA brachten Signalerhöhungen. Auf dem passivierten Silber konnte im Vergleich zum unpassiviertem Silber eine deutlich geringere Signaldrift beobachtet werden. Der vorgenommene Schichtaufbau kann für DNA-Mikroarrays mit vielen Einzelnachweisen pro Flächeninhalt angewendet werden. Das passivierte Silber mit MUD und (3-Bromopropyl)trichlorosilan ist geeignet für Immobilisierung von PT-DNA und anschließende Hybridisierung mit komplementärer DNA.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung der PCR-Chemie für Y-chromosomale SNP-Analysen, wobei eine vorangegangene Forschungsarbeit die Grundlage für den Optimierungsprozess bildet. Dabei soll auf die Verwendung eines kommerziellen Kits zur Durchführung der Amplifikation des genetischen Materials verzichtet werden. Die für die Analysen herangezogene DNA stammt aus historischem Knochenmaterial eines Gräberfeldes nahe Görzig. Abschließend sollen die untersuchten Proben hinsichtlich der detektierten Y-SNPs bewertet werden.
Produktion von rekombinanten
Proteinen zur Verwendung in
Reagenzien für die in-vitro
Diagnostik
(2015)
Hefen sind widerstandsfähig, haben eine vergleichsweise hohe Reproduktionsrate und bieten eine Vielzahl posttranslationaler Modifikationen und Sekretionswege. Aus diesem Grund wurde die Hefe P. pastoris als Expressionswirt ausgesucht, um das Enzym Cholesterinesterase rekombinant herzustellen. Dafür soll ein Klon mit hoher Enzymausbeute erzeugt werden. Zusätzlich musste das optimale Kultivierungsmedium gefunden, die Langzeitstabilität ermittelt und gleichzeitig die Funktionalität in einem Reagenz nachgewiesen werden, in dem es später als eine Komponente eingesetzt werden soll. Es wurden die drei Stämme von P. pastoris X33, SMD1168H und KM71H eingesetzt, um jeweils die Plasmide pGAPZαA-COE1 und pGAPZαA-COE1-6H mithilfe der Elektroporation in die Stämme zu transformieren. In der Zelle wird das Plasmid durch homologe Rekombination in das Hefegenom integriert. Zum
Linearisieren der Plasmid-DNA wurden die Restriktionsenzyme AvrII und BspHI eingesetzt. Daraus ergab sich die Kombination aus Stamm, Restrkitionsenzym und Konstrukt, welche den Klon mit der höchsten Ausbeute erzeugt. So wurde der Klon E1 mit einer Enzymaktivität von 8,2 U/mL erzeugt, indem das Konstrukt pGAPZαA-COE1-6H mit dem Restriktionsenzym AvrII in den Stamm KM71H transformiert wurde. Die Enzymaktivität wurde mit einer Methode ermittelt, die auf der Reaktion des Enzyms mit p-Nitrophenoloctanoaten basiert. Im weiteren Verlauf wurde das Kultivierungsmedium für den Klon optimiert. Von den drei eingesetzten Medien SYN6, FM22 und YNB stellte sich SYN6 als das Medium mit der höchsten Ausbeute heraus.
Eine weiterführende Variierung der CaCl-Konzentration im Kultivierungsmedium ergab eine optimale Konzentration von 1%, bei gleichzeitiger Erhöhung der Langzeitstabilität.
Zusätzliche Versuche zur Erhöhung der Langzeitstabilität mit Zusätzen wie RSA, Glycerin oder EDTA ergaben, dass die Langzeitstabilität am besten ohne jegliche Zusätze garantiert werden kann. Weiterführend muss über ein Scale-up Prozess
nachgedacht werden und parallel dazu ein downstream-Prozess entwickelt werden, um die steigende Menge an Kulturüberstand verarbeiten zu können.