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Nutzung von CYTOF zur Detektion von ILC-Subpopulationen in der Haut von Patienten mit Psoriasis
(2022)
Psoriasis ist eine durch exogene und endogene Stimuli auslösbare, T-Zellen vermittelte Autoimmunerkrankung, die gekennzeichnet ist durch Hyperproliferation und veränderten Differenzierung von Keratinozyten in der Epidermis. Bei den Betroffenen bilden sich auf der Haut scharf begrenzte, rote oder mit weißen Schuppen bedeckte Papeln oder Plaques.
Man fand in den letzten Jahren heraus, dass eine neu entdeckte Lymphozyten Population, die sogenannten angeborenen lymphatischen Zellen (innate lymphoid cells (ILC)), einen Einfluss auf die Pathogenese der Erkrankung haben.
ILCs lassen sich anhand ihrer Oberflächenmarker in drei Gruppen einteilen. Besonders die Gruppe 3 der ILCs (ILC3) wurde in der Haut von Psoriasis-Patienten angereichert gefunden. Zum jetzigen Zeitpunkt ist jedoch nicht vollständig geklärt wie die ILCs vom Blut in das Gewebe migrieren.
Um ein besseres Verständnis über das Migrationsverhalten von ILCs bei Psoriasis zu erlangen, ist das Ziel der Arbeit, neue Subpopulation von ILCs zu identifizieren, die sowohl im Blut als auch auf dem Hautgewebe zu finden sind. Für die Etablierung dieser Methode wurden zuerst die im Blut von Psoriasis-Patienten und gesunden Patienten befindlichen ILCs durch Durchflusszytometrie von anderen Immunzellen getrennt. Mittels t-SNE-Algorithmus wurde anschließend innerhalb der ILC-Population nach Subpopulationen gesucht. Anhand von Oberflächenmarkern und fünf Chemokinrezeptoren, die unter anderem an der Migration beteiligt sind, konnten verschiedene ILC-Subpopulation identifiziert werden.
Um zu überprüfen, ob diese ILC-Subpopulation vom Blut ins Gewebe migrieren, sollten die ILC-Subpopulationen vom Blut anhand des Antikörperpanels der Durchflusszytometrie mittels „Imaging Mass Cytometry“ (IMC) im Gewebe von Psoriasis-Patienten identifiziert und lokalisiert werden. Vorteil von IMC gegenüber herkömmlicher Immunhistologie, ist die Nutzung von bis zu 40 parallel nutzbaren Markern im Gewebe. Dies ermöglicht die Suche nach ILC-Subpopulation durch die gleichzeitige Identifizierung von ILCs anhand von Oberflächenmarkern, als auch ihrer Chemokinrezeptoren.
In dieser Arbeit, konnte ein Antikörperpanel mit 30 Markern auf einem Gewebeschnitt untersucht und mittels der Programmiersprache R eine Analyse erstellt werden, die es erlaubt ILCs auf dem untersuchten Gewebe sichtbar zu machen, sowie die ILCs hinsichtlich der Expression ihrer Chemokinrezeptoren zu untersuchen.
In dieser Bachelorarbeit war das Hauptziel die Etablierung eines Antikörper Panels für T-Zellen und MDSCs für die Analyse von Leukozyten in Psoriasis vulgaris Blut- und Gewebeproben. Psoriasis ist eine chronische Entzündungserkrankung der Haut und betrifft rund 2-3 % der Bevölkerung weltweit. Die Untersuchung der verschiedenen Zelltypen erfolgte dabei mit Hilfe der Durchflusscytometrie. Im ersten Teil dieser Arbeit mussten dafür die Antikörper mit Beads titriert werden, um deren optimale Einsatzkonzentration zu finden und mögliche falsche Ergebnisse in späteren Probenanalysen ausschließen zu können. Es wurde für jeden Antikörper eine Konzentration ausgewählt, jedoch gab es bei einigen keine Eindeutigen Ergebnisse, wie bei CCR4 und CD45RA, für die weitere Titrationsschritte nötig wären. Im Anschluss wurde erfolgreich eine Kompensation mit diesen Antikörpern durchgeführt. Nach Etablierung des Antikörperpanels wurden Blut- und Gewebeproben zweier Psoriasis betroffenen Patienten auf T-Zellen und MDSCs vor und unter Therapie betrachtet. Die Therapie erfolgte mit Anthralin, dessen Wirkung noch nicht vollständig geklärt ist. Für die Gewebeprobenanalyse wurden zuvor drei Varianten für die Isolation der Immunzellen aus Gewebe ausgetestet. Dabei unterschieden sich die Varianten in der Inkubationszeit mit DNase und Kollagenase. Die Überprüfung innerhalb einer Patientenprobe mit der ausgewählten Variante war jedoch nicht erfolgreich. Um die Zelltypen aus Blutproben betrachten zu können, wurden PBMCs aus dem Blut isoliert und die Zellen anschließend mit den Antikörpern gefärbt. Bei beiden Patienten zeigte sich die Th17.1-Population als größte und die Th2-Population als kleinste. Dass die Psoriasis eine Th17 dominierte Krankheit ist, konnte damit bestätigt werden. Es gab kaum Veränderungen innerhalb der Subpopulationen zum 2. Zeitpunkt. Für die MDSCs zeigte sich eine größere PMN-MDSC Population. Dies könnte zeigen, dass die während einer Anthralinbehandlung rekrutierten MDSCs, der Gruppe der PMN-MDSCs angehören. Jedoch ähneln sich diese in ihrer Morphologie mit denen der Neutrophilen, weshalb die Überprüfung der T-Zell Suppression, welche nur durch die MDSCs gegeben ist, mittels CFSE-Färbung angeschlossen werden sollte. An diese Bachelorarbeit schließt sich eine weitere Studie an, welche sich näher mit der Wirkungsweise der Anthralinbehandlung bei Psoriasis und der damit verbundenen MDSCs beschäftigen wird.