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In der regenerativen Medizin, insbesondere beim Tissue Engineering, spielt die natürliche extrazelluläre Matrix eine große und immer bedeutsamere Rolle. Ein wichtiger Schritt für die medizinische Anwendung ist die Probenvorbereitung. Um die genaue Zusammensetzung des fertigen Produkts bestimmen zu können, muss eine einheitliche Methode für die Extraktion der Bestandteile zur Verfügung stehen. Ein anderer Teil der Probenvorbereitung ist die Dezellularisierung. Um bei der Anwendung in der regenerativen Medizin Abstoßungsreaktionen zu vermeiden, sollen die Zellen des zur Herstellung des Produkts verwendeten Gewebes nahezu vollständig entfernt werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Extraktion der extrazellulären Matrix optimiert und etabliert. Zusätzlich wurden verschiedene Dezellularisierungsansätze für die Gewebe untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Extraktion mit dem GuHCl-Puffer für 24 beziehungsweise 48 h gute Ergebnisse bei der anschließenden Evaluation mittels Massenspektrometrie mit sich bringt. Allerdings ist der Erfolg der Extraktion stark gewebeabhängig. Für die Dezellularisierung hat sich die Anwendung des pH-WechselVerfahrens als wirksam erwiesen. Jedoch konnten mit Hilfe der gewählten Bedingungen die bestehenden Grenzwerte für eine erfolgreiche Dezellularisierung nicht erreicht werden.
A Protein is a large molecule that consists of a vast number of atoms; one can only imagine the complexity of such a molecule. Protein is a series of amino acids that bind to each other to form specific sequences known as peptide chains. Proteins fold into three-dimensional conformations (or so-called protein’s native structure) to perform their functions. However, not every protein folds into a correct structure as a result of mutations occurring in their amino acid sequences. Consequently, this mutation causes many protein misfolding diseases. Protein folding is a severe problem in the biological field. Predicting changes in protein stability free energy in relation to the amino acid mutation (ΔΔG) aids to better comprehend the driving forces underlying how proteins fold to their native structures. Therefore, measuring the difference in Gibbs free energy provides more insight as to how protein folding occurs. Consequently, this knowledge might prove beneficial in designing new drugs to treat protein misfolding related diseases. The protein-energy profile aids in understanding the sequential, structural, and functional relationship, by assigning an energy profile to a protein structure. Additionally, measuring the changes in the protein-energy profile consequent to the mutation (ΔΔE) by using an approach derived from statistical physics will lead us to comprehend the protein structure thoroughly. In this work, we attempt to prove that ΔΔE values will be approximate to ΔΔG values, which can lead the future studies to consider that the energy profile is a good predictor of protein binding affinity as Gibbs free energy to solve the protein folding problem.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die sekretorische Produktion des DESIGNER-Proteins DP10A durch Pichia pastoris untersucht. Dazu wurde die DNA-Sequenz des Zielproteins in den Vektor pPICZαA kloniert und in das Genom von Pichia pastoris durch homologe Rekombination integriert. Für die Auswahl eines geeigneten Klons wurde ein Klon-Screening durchgeführt. Zusätzlich wurde die Produktion des Zielproteins bei verschiedenen pH-Werten sowie die Löslichkeitsverteilung von intrazellulär vorliegendem DP10A untersucht.
Das DESIGNER-Protein DP10A konnte mit P. pastoris produziert werden. Allerdings konnte das Ziel einer sekretorischen Produktion nicht erreicht werden, da DP10A nur intrazellulär und hauptsächlich unlöslich in der Zelle vorlag.