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Nutzung von CYTOF zur Detektion von ILC-Subpopulationen in der Haut von Patienten mit Psoriasis
(2022)
Psoriasis ist eine durch exogene und endogene Stimuli auslösbare, T-Zellen vermittelte Autoimmunerkrankung, die gekennzeichnet ist durch Hyperproliferation und veränderten Differenzierung von Keratinozyten in der Epidermis. Bei den Betroffenen bilden sich auf der Haut scharf begrenzte, rote oder mit weißen Schuppen bedeckte Papeln oder Plaques.
Man fand in den letzten Jahren heraus, dass eine neu entdeckte Lymphozyten Population, die sogenannten angeborenen lymphatischen Zellen (innate lymphoid cells (ILC)), einen Einfluss auf die Pathogenese der Erkrankung haben.
ILCs lassen sich anhand ihrer Oberflächenmarker in drei Gruppen einteilen. Besonders die Gruppe 3 der ILCs (ILC3) wurde in der Haut von Psoriasis-Patienten angereichert gefunden. Zum jetzigen Zeitpunkt ist jedoch nicht vollständig geklärt wie die ILCs vom Blut in das Gewebe migrieren.
Um ein besseres Verständnis über das Migrationsverhalten von ILCs bei Psoriasis zu erlangen, ist das Ziel der Arbeit, neue Subpopulation von ILCs zu identifizieren, die sowohl im Blut als auch auf dem Hautgewebe zu finden sind. Für die Etablierung dieser Methode wurden zuerst die im Blut von Psoriasis-Patienten und gesunden Patienten befindlichen ILCs durch Durchflusszytometrie von anderen Immunzellen getrennt. Mittels t-SNE-Algorithmus wurde anschließend innerhalb der ILC-Population nach Subpopulationen gesucht. Anhand von Oberflächenmarkern und fünf Chemokinrezeptoren, die unter anderem an der Migration beteiligt sind, konnten verschiedene ILC-Subpopulation identifiziert werden.
Um zu überprüfen, ob diese ILC-Subpopulation vom Blut ins Gewebe migrieren, sollten die ILC-Subpopulationen vom Blut anhand des Antikörperpanels der Durchflusszytometrie mittels „Imaging Mass Cytometry“ (IMC) im Gewebe von Psoriasis-Patienten identifiziert und lokalisiert werden. Vorteil von IMC gegenüber herkömmlicher Immunhistologie, ist die Nutzung von bis zu 40 parallel nutzbaren Markern im Gewebe. Dies ermöglicht die Suche nach ILC-Subpopulation durch die gleichzeitige Identifizierung von ILCs anhand von Oberflächenmarkern, als auch ihrer Chemokinrezeptoren.
In dieser Arbeit, konnte ein Antikörperpanel mit 30 Markern auf einem Gewebeschnitt untersucht und mittels der Programmiersprache R eine Analyse erstellt werden, die es erlaubt ILCs auf dem untersuchten Gewebe sichtbar zu machen, sowie die ILCs hinsichtlich der Expression ihrer Chemokinrezeptoren zu untersuchen.
In dieser Masterarbeit wird sowohl säurelösliches Kollagen, als auch Gelatine als Ausgangsmaterial verwendet. Dieser Ausgangsstoff wird anschließend funktionalisiert und verschieden photovernetzt, um verschiedene nanomechanischen Eigenschaften zu generieren. Diese werden durch statische Rasterkraftspektroskopie untersucht. Das modifizierte Kollagen und Gelatine werden dann nach DIN auf ihre Zytotoxizität getestet. Nach erfolgreicher Überprüfung werden Zellversuche vorgenommen um die Zellantwort auf die unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften untersucht. Zuletzt wird in Gelatine die Oberflächenmorphologie von Kollagen gestempelt und eine Veränderung der Zellantwort zu nicht gestempelter Gelatine überprüft.
Liegt in menschlichen Zellen eine Mutation im Enzym Isocitrat-Dehydrogenase 1 (IDH1) vor, kommt es zur einer erhöhten Produktion des Metaboliten D-2-Hydroxyglutarat (D2HG), wodurch die Entstehung weiterer Mutationen begünstigt wird. Um das IDH1-Enzym zu inhibieren und damit die D2HG-Konzentration in den Zellen zu verringern, sollten die Wirkstoffe AGI-5198 und FMLW-12 getestet werden. Dabei wurde zum einen die Zelllinie HT1080 mit der IDH1-Mutation R132C und zum anderen die Referenzzelllinien HeLa und 143B, die den Wildtyp aufweisen, verwendet.
Bei der Kultivierung der Zelllinie HT1080 mit AGI-5198 konnte neben einer langsameren Proliferation der Zellen auch eine Verringerung der D2HG-Konzentration beobachtet werden, was zeigt, dass AGI-5198 das mutierte IDH1 inhibiert. Bei HeLa und 143B zeigte sich keine Veränderung der D2HG-Konzentration, allerdings wirkte AGI-5198 in höheren Konzentrationen toxisch auf 143B.
Auch der Wirkstoff FMLW-12 konnte die D2HG-Konzentration in der Zelllinie HT1080 senken, während HeLa und 143B nicht beeinflusst wurden. Jedoch musste das Detergens Digitonin zur Permeabilisierung der Zellmembran eingesetzt werden, da FMLW-12 diese ansonsten nicht passieren konnte.