In dieser Arbeit wurden neuartige Proteasen aus psychrotoleranten Bakterienstämmen isoliert und auf ihre biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Des Weiteren konnten S8 Familie Proteasen Gene amplifiziert werden und Unterschiede in der Aminosäuresequenz konnten in Zusammenhang mit den biochemischen Eigenschaften der Proteasen in Verbindung gebracht werden.
Im Rahmen der Arbeit sollte ein Modell zur Evaluierung des diagnostischen Einsatzes von D-stereospezifischen Hydrolasen- und varianten generiert werden. Als Modell diente artifizielles Parvulin 10 mit einer substituierten D-Aminosäuren. Dadurch musste eine halbysnthetische Synthese mit Fragmenten erfolgen. Das N-terminale Fragment (1-67), auch Thioester genannt, wurde aus E. coli an einer fusionierten Intein-Chitinbindedomäne exprimiert. Mithilfe einer Kombination aus Affinitätschromatographie und verändertem Proteinspleißens konnte das Fragment an einer Chitinsäule zu einem Thioester umgebaut werden. Die erfolgreiche Expression und der Umbau mittels Proteinspleißens konnten dabei per SDS-Page erfolgreich nachgewiesen werden. In den C¬-terminalen Fragmenten (68-92), auch Peptide (Pf, Py, Pv) genannt, wurde jeweils eine L-Aminosäure per SPPS in eine D-Aminosäure substituiert. Diese Substitution ist für die Validierung der DHys erforderlich. Die Rohprodukte der SPPS konnten erfolgreich mittels präparativer HPLC gereinigt werden. Der Nachweis erfolgte mittels UPLC-MS. Durch eine anschließende initiale Hydrolysestudie der Peptide wurde die generelle Substratzugänglichkeit für die DHys belegt. Die Auswertung erfolgte per UPLC-MS. Nachfolgend wurden beide Substrate mittels natürlich chemischer Ligation verknüpft um Parvulin-Derivate zu erhalten. Die Überprüfung erfolgte per SDS-Pages. Die Hydrolyse des Thioesters begrenzte die Ausbeute sehr stark. Die höchste Ausbeute zeigten Ansätze mit Peptid-Thioester-Verhältnis von 1:3, Thiophenol und der Zugabe von DMSO als Lösungsmittel. Es wurde kein quantitativer Umsatz erreicht. Deshalb war eine Reinigung des Ansatzes nötig. Diese erfolgte Aufgrund verschiedener physikalisch-chemischen Eigenschaften der Reaktanten, Molekulargewichten, polarer Wechselwirkungen und Hydrophobizitäten. Die Auswertung der Reinigungen erfolgte per SDS-Pages. Trennungen nach Hydrophobizität erwies sich am erfolgreichsten. Von dem gereinigten Parvulin-Derivat wurde die Aktivität mittels etabliertem Assay überprüft. Es konnte die Generierung von aktivem artifiziellen Parvulin bestätigt werden. Das Modellprotein konnte erfolgreich dargestellt werden und steht für eine weiterführende Untersuchung zur Validierung mit D-stereospezifischen Hydrolasen zur Verfügung.
Background: Neurodegenerative diseases are on the rise. A possible link between the exposure and residue of neuroactive compounds to the environment and humans was found in recent years. At the present day the effects of chemical mixtures are a field of great concern. However aquatic communities and organism seem even more vulnerable to adverse effects of toxic mixtures. Zebrafish was selected as suitable in vivo model to investigate these concerns. The possible effects of nine selected compounds and four binary mixtures were assessed by an evaluation of movement change in D. rerio embryos at early life stages.
Results: The investigation has shown various changes in the behavior of D. rerio embryos for eight of nine tested compounds and their mixtures, respectively. The STC (spontaneous tail coiling)-method revealed changes in hyper- and hypoactivity in zebrafish.
Conclusions: This report demonstrates the advances of investigating sublethal behavior-related endpoints linked to observed effects regarding to a specific mode of action or to a certain group of compounds, respectively. Furthermore, the STC-method proved to be a promising tool to detect, evaluate and investigate combined effects in binary mixtures.
Keywords: Danio rerio embryos, behavior, mixtures, neurotoxicity, sublethal endpoints, STC-method, movement change